Desde el principio estuvieron los Monjes Jerónimos. Testigo de ello son los cuadros de tonos solemnes en los que aparecen acompañando al rey y de los cuales algunos se exhiben en Yuste.

Es en 1958, una vez recuperado el edificio los jerónimos vuelven al Monasterio hasta finales del 2007, año en el que los monjes Jerónimos lo vuelven a abandonar para reagruparse con otros Jerónimos en un convento de Segovia.
Después de muchas vicisitudes, de ser saqueado en la guerra napoleónica y de pasar por muchas manos, en 1958, una vez recuperado el edificio los jerónimos vuelven al Monasterio hasta finales del 2007, año en el que los monjes lo vuelven a abandonar para reagruparse con otros Jerónimos en un convento de Segovia.

Durante 5 años, desde el 2007 hasta marzo del 2013, el monasterio estuve sin monjes. Actualmente la nueva orden que ha ocupado el monasterio es la Orden de San Pablo Primer Eremita, formada por tan solo 2 monjes polacos.